正确评价药品检验中的不确定度是药物分析中的一个难点，有人对HPLC测定咖啡因的不确定度进行了研究，但尚未见关于抗生素微生物检定法测定中含量不确定度的报道。本文以阿奇霉素标准品的含量标定为例，对抗生素微生物检定法中的不确定度计算进行探讨研究，以提高数据分析和测定结果的准确性和可信度。    

　　一、实验部分

　　1.仪器与试剂
　　ZY-300IV多功能微生物自动测量分析仪(北京先驱威锋技术开发公司)；BP-211D分析天平(瑞士Sartorius公司)；电热隔水式恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；阿奇霉素标准品(中国药品生物制品检定所，效价测定用，946μ/mg，批号:130352-200304)与阿奇霉素供试品(中国药品生物制品检定所)；Ⅰ号7.8～8.0培养基(批号—040212，北京三药科技开发公司生产、中国药品生物制品检定所监制)；短小芽孢杆菌〔CMCC(B)63 202〕(中国药品生物制品检定所)；磷酸二氢钾与磷酸氢二钾等试剂均为分析纯；水为去离子纯化水。

　　2.标准品溶液与供试品溶液的制备
　　(1)标准品溶液的制备:精密称取阿奇霉素标准品0.05285g，加乙醇28mL使之溶解，再加灭菌水定量稀释至50mL，摇匀，得溶液为1000μ/mL。精密吸取该溶液(1000μ/mL)5.0mL，用磷酸盐缓冲液(pH7.8)稀释至50mL，摇匀，得溶液为100μ/mL；再分别精密吸取溶液(100μ/mL)5.0mL，分别用磷酸盐缓冲液(pH7.8)稀释至50mL与100mL，摇匀，得溶液分别为10μ/mL与5μ/mL，作为标准品溶液的高、低剂量。

　　(2)供试品溶液的制备:精密称取阿奇霉素供试品0.05260g(估计效价950.6μ/mg)，溶解与稀释同标准品溶液的制备，得溶液分别为10μ/mL与5μ/mL，作为供试品溶液的高、低剂量。

　　3.双碟的制备与培养
　　取平底双碟约10套(n)，分别加入加热融化的培养基20mL，放置水平台上使凝固，作为底层。另取加热融化后的培养基适量，放冷至50℃，加入短小芽孢杆菌的菌悬液适量，摇匀，在每一双碟中分别加入5mL，摊布均匀，作为菌层。冷却后，在每一双碟中以等距离安置不锈钢小管4(k)个，待用。将上述稀释好的标准品溶液与供试品溶液分别滴加于不锈钢小管内，在(35～37)℃恒温培养箱中培养(16～18)小时。

　　4.抑菌圈直径的测定与效价计算
　　取出培养好的双碟，用抑菌圈测量仪测量各个抑菌圈的直径，照生物检定统计法(中国药典2005年版二部附录XI V中的2.2法)进行可靠性检验与效价计算。当可靠性检验结果为回归非常显著(P<0.01)与偏离平行不显著(P>0.05)时，实验结果才成立。    

　　二、结果与讨论

　　1.数学模型
　　被测量是供试品的效价，它取决于标准品的质量、纯度与供试品的质量、标准品溶液产生的直径、供试品溶液产生的直径。抑菌圈直径测定时，分别对10个双碟进行扫描测定，测定结果见表1。
    

表1  抑菌圈测量的直径值(d)

　　效价由下式给出:
    

　　式中，ms与</i></HTML>mt</i></HTML>分别为标准品与供试品的质量，5mL为移液管的体积，50mL与100mL均为容量瓶的体积。常数0.3010，由浓度间的比率决定，与所用双碟数无关，因此，剂距为2∶1不变时，增加双碟数，常数0.3010仍不变。S₂为n个双碟高浓度标准品溶液所制的抑菌圈直径值的总和，S₁为n个双碟低浓度标准品溶液所制的抑菌圈直径值的总和；T₂为n个双碟高浓度供试品溶液所制的抑菌圈直径值的总和，T₁为n个双碟低浓度供试品溶液所制的抑菌圈直径值的总和。

　　除抑菌圈直径值引起的输入量的标准不确定度外，不确定度还包括标准品和供试品的称重、标准品纯度、容量瓶体积、移液管体积、抑菌圈测量仪等。这个合成的不确定度即为效价测定的不确定度。

　　2.各分量的标准不确定度
　　(1)抑菌圈直径值的不确定度分量u(x₁)
　　对抑菌圈直径的数据进行统计分析，根据上述公式计算效价(y)为934.2μ/mg，同时统计分析得自由度f=(k-1)(n-1)=27，其合并样本标准差即标准不确定度为:
    

　　相对标准不确定度为:
　　u(x₁)_rel=u(x₁)/y=0.159/934.24=1.70×10^-4

　　(2)抑菌圈测量仪的不确定度分量u(x₂)
    

　　抑菌圈测量仪的最大允许误差为±0.02mm，则区间半宽度aP=0.02mm，测量值落在该区间的概率分布为均匀分布，包含因子，其标准不确定度为:
　　移菌圈测量仪的标准圈直径为19mm，其相对标准不确定度为:
    

　　(3)配制溶液的不确定度分量u(x₃)
　　①标准品溶液的不确定度u_s(x₃)
　　a.定容体积V的标准不确定度u_v，A级100.00mL单标线容量瓶的容量误差允许±0.1mL，按三角分布考虑，取，则标准不确定度，相对标准不确定度为0.04/100=0.0004。

　　用A类方法评定，即通过对容量瓶的重复实验可以估算定容变动产生的不确定度。液体的体积与其比重的乘积等于其重量，同一液体的比重为常数，因此可以对典型的100mL容量瓶定容10次，并称量求取其标准偏差来评价其容量配置的重复性。采用贝塞尔方法计算标准偏差，标准不确定度等于1倍标准偏差，用A级100.00mL容量瓶配制溶液，稀释至刻度线的度数，重复性引起的不确定度为0.04mL。配置溶液时，水温接近20℃，因而温度的影响可忽略不计，则定容体积V的标准不确定度为:，相对标准不确定度为:u_v1rel=0.06/100.00=0.0006。
　　同样地，50.00mL容量瓶的标准不确定度与相对标准不确定度分别为:u_v2=0.05mL与u_v2rel=0.0005。
　　使用100.00mL容量瓶1次与50.00mL容量瓶3次，因此定容体积的合成标准不确定度为:
    

　　b.移取溶液的不确定度分量u_νyrel
　　考虑到移取溶液体积量，认为移取溶液的不确定度来自于移液管刻度的不确定度，根据规定，5mL移液管的最大允许误差为±0.015mL，按三角分布考虑，取，则。

　　用A类方法评定，重复性引起的不确定度为0.008mL。配置溶液时，水温接近20℃，因而温度的影响可忽略不计，使用移液管2次，则移取溶液的标准不确定度为:，相对标准不确定度为:。
    c.标准品纯度引起的不确定度u_mc
    阿奇霉素标准品含量的标准不确定度为1%，取，则
    d.标准品质量的标准不确定度u_m
    天平使用说明书给出的天平的分辨力为0.01mg，包含因子，则天平的不确定度
    天平使用说明书给出的天平的重复性误差为0.02mg，认为服从矩形分布，包含因子，则称量重复性不确定度
    标准品质量的相对标准不确定度
    合成标准品溶液的不确定度u_s(x₃)
    

    ②供试品溶液的不确定度u_T(x₃)
    同样计算:
    a.定容体积V的标准不确定度u_vrel
    

    b.移取溶液的不确定度分量u_νyrel
    

    c.供试品质量的标准不确定度u_m
    供试品质量的相对标准不确定度u_mrel
    

    合成供试品溶液的不确定度u_T(x₃)
    

    因而配制溶液的不确定度
    

　　3.总合成标准不确定度u(y)
　　合成标准不确定度由抑菌圈直径值观测列的不确定度即A类不确定度u(x₁)与B类不确定度即移菌圈测量仪的标准不确定度u(x₂)、配置溶液的不确定度u(x₃)组成，它们是各自独立的分量，因而可按方和根方式进行合成标准不确定度的计算:    

　　4.扩展不确定度
　　实验结果一般用扩展不确定度表示。u(y)/y=0.0030，y=934.24μ/mg，u(y)=0.0030×934.24μ/mg=2.80μ/mg。取包含因子k=2(置信概率约为95%)，则扩展不确定度为U=2u(y)=2×2.80μ/mg=5.6μ/mg。阿奇霉素效价测定的结果可表示为:(934.2±5.6)μ/mg(k=2)。    

　　三、总结

　　不同参数对效价测定不确定度的贡献不同，标准品质量与供试品质量对不确定度的贡献最大；其次为移液管体积不确定度与容量瓶体积不确定度；标准品纯度的不确定度、抑菌圈直径值的不确定度及抑菌圈测量仪不确定度实际上对总不确定度没有影响。

　　根据效价测定的特点，其操作方法可分为供试品和标准品的称量、供试品和标准品溶液的制备、双碟的制备与培养、抑菌圈直径值的测量与效价计算等步骤，因此，在计算时，应先分别计算各过程的不确定度，再计算合成相对不确定度，这样方便理解和计算。
　　作者单位【河南省药品检验所】